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外泌體分離提取方案。主要方案包括:
1、差速超1速離心法;
適用于細胞上清、灌洗液、尿液等大體積的樣品;
2、基于PEG沉淀原理的試劑盒法;
適用于血1清、腦脊液等小體積的樣品;
3、超濾提取法;
適用于細菌培養液或外泌體含量較低的樣品濃縮。亦可搭配超1速離心法,做進一步的提取。
外泌體是細胞外囊泡的一種,其膜來源與粒徑范圍與細胞外囊泡相似,電鏡下,顯示出典型的茶托狀超微結構。實際操作中,通過常規的單一的方法很難鑒定外泌體。鑒定外泌體需要包含形態、粒徑、表面分子標記物等多方面的鑒定。具體方法包括:透射電鏡(形態鑒定)、NTA檢測(粒徑及濃度鑒定)、WB(分子標志物)。NTA檢測作為外泌體鑒定的經典方法之一,可同時反映出檢測樣品的濃度及粒徑。質量較好,純度較高的外泌體樣品,粒徑分布在30-150nm,原液濃度在10^9左右。為了保證檢測質量,對每一個樣品,都會進行3次技術重復。檢測周期為2-3個工作日,可當天到樣當天出結果。
NTA可以提供樣本中顆粒的粒徑分布和絕1對濃度,但不能夠以NTA所提供的濃度數值這個單一的指標來定量外泌體。首先,我們必須理解NTA檢測原理:該技術基于布朗運動,通過視頻分析顆粒計數,可同時獲取樣本中顆粒的粒徑和絕1對濃度。
因此,樣本中的所有顆粒,都會被偵測并計入,而不能篩選出外泌體單獨進行計數;同理:也不能通過NTA所提供的粒徑分布情況這個單一的指標判斷所提取出的內容物就是外泌體;例如下圖為常見的粒徑濃度分布圖,可以說明所提取的內容物是在外泌體粒徑范圍內,但是否為外泌體還需要結合其他方法綜合驗證,譬如:透射電鏡、western blot等。
關于層方面1. 促進成纖維細胞的增殖能力成纖維細胞是層主要的細胞,在體內幾乎不增殖,且隨著年齡增長其數量和活性也隨之下降,其功能受損及細胞外基質的改變與外源性皮膚老化密切相關。
外泌體可增強成纖維細胞的增殖能力,具有濃度依賴性,可逆轉紫外線誘導的成纖維細胞老化,但對內源性老化因素所致細胞衰老作用不明顯。